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    2. 甲基化檢測丨探索文庫構建中更溫和的DNA處理方式

      【導語】目前較常使用的DNA甲基化檢測方法大都需要BS(重亞硫酸氫鹽)處理,該技術容易導致絕大多數DNA分子發生斷鏈。本文主要對甲基化文庫構建過程中BS處理方案和酶處理方案進行對比,供方案評估與選擇參考。

      文章 | 元碼基因??編輯 | 羅湘? 關鍵詞 | DNA甲基化
      DNA甲基化
      DNA甲基化是DNA化學修飾的一種形式,能在不改變DNA序列的前提下,改變遺傳表現。

      DNA胞嘧啶第五位的甲基化在多種生物中是穩定存在的一種表觀修飾,它已知在胚胎發育、轉座子沉默、X染色體失活、細胞分化等多種過程中通過轉錄活性調節起到重要作用。

      圖:DNA甲基化(來源/Google)
      自1992年[1]首次使用以來,重亞硫酸氫鹽(BS)測序DNA已成為分析DNA甲基化的金標準。對DNA的BS處理導致未修飾的胞嘧啶轉化為尿嘧啶,同時保持5mC不變,經過PCR和測序,可以在單堿基分辨率[2,3]上定位。
      最近,BS處理和二代測序相結合可以得到5mC的全基因組分布情況,比如Reduced Representation BS(RRBS)或者Whole Genome BS(WGBS)方法。
      隨著二代測序價格的降低以及捕獲方法的普及,WGBS和Target-BS方法越來越容易應用于基礎和臨床研究。
      目前的DNA處理方案、甲基化文庫構建方案的方案較多,根據不同的性能要求和應用需求,要評估和選擇不同的方案。
      BS處理DNA甲基化測序的金標準

      對DNA進行重亞硫酸氫鹽處理是最常見的DNA處理方式,也是DNA甲基化測序的金標準。但該方法有其明顯的缺陷,比如處理后會對DNA造成斷裂,占比高達90%[2, 4, 5, 6, 7]。

      為了保證后續文庫的多樣性,對DNA的起始量有較高的要求,所以在處理cfDNA樣本這種起始量較低的樣本時,BS的處理方法相對比較困難;再比如BS處理后片段斷裂有序列特異性,以及對胞嘧啶的轉化也并非是100%,這些缺陷也會造成后續甲基化分析時的偏差。

      Nelly Olova等人[8]研究了BS過程中不同的加熱處理的溫度、時間、變性方法等條件對后續測序結果的覆蓋度、偏好性的影響(如下圖所示),高溫加熱和高濃度的亞硫酸氫鹽都會對DNA造成更嚴重的損傷。

      圖:BS轉換協議和參數

      (來源/doi:10.1186/s13059-018-1408-2)

      所以BS和二代測序的結合,需要搭配合適的實驗流程才能有較為理想的數據結果,具體的實驗中DNA BS處理的前后順序對結果也是有影響的。

      Pre-BS(先建庫后亞硫酸氫鹽處理)的意思是先對DNA進行打斷,后續連接接頭,后續再進行DNA處理。

      Post-BS(亞硫酸氫鹽處理后再建庫)的意思是先進行DNA BS處理,后續再連接接頭。

      Nelly Olova等人在不同的DNA處理方案的研究基礎上,也研究了不同的文庫構建流程對后續數據的影響。

      圖:BS前處理和后處理的WGBS文庫制備方案的數據總結

      (來源/doi:10.1186/s13059-018-1408-2)

      研究人員發現不同的WGBS的實驗流程會有非常不同的數據結果,pre-BS的方案整體數據出現偏差,尤其是在DNA的降解上。這和流程中先連接文庫接頭,再進行DNA處理有關,這樣會有很多不完整的文庫無法進行測序。

      同時也可以看出在Post-BS的流程中,amplification-free的方案下產出的數據偏差和準確性是最高的。

      在元碼基因目前的應用中,使用的是Post-BS方案。由于樣本多來自于體液的cfDNA,DNA量較少,經過BS處理后又會形成大量斷裂的單鏈DNA,需要盡可能的提高DNA的文庫轉化率,所以對下游的建庫方案進行了優化,使用基于單鏈的文庫構建方案,對DNA建庫起始量的要求大大減低(如下圖所示)。

      圖:元碼文庫構建方案(來源/元碼基因)

      酶處理方案更加溫和的DNA處理方式

      根據研究,傳統的DNA甲基化數據會產生偏差的根本原因是BS處理對DNA極大的損傷,所以更加溫和的DNA處理方式是研究的方向。

      NEB(New England Biolabs 公司)推出了一款使用酶進行處理的試劑盒,NEBNext EM-seq利用酶促轉化來取代亞硫酸氫鹽轉化,能夠最大限度減少DNA損傷。

      圖:亞硫酸氫鈉轉化和EM-seq概述

      (來源/NEB)

      EM-seq中對DNA的酶處理分為兩步:

      第一步使用TET2酶以及氧化增強劑將5mC和5hmC氧化成5caC,保護經過修飾的胞嘧啶;

      第二步利用脫氨酶APOBEC對胞嘧啶進行脫氨處理,此步驟不會對5caC造成影響。

      此外,EM-seq的轉化結果與亞硫酸氫鹽測序一致,故可采用原先的數據分析工具。

      另外一種酶處理DNA的方法是牛津大學路德維格癌癥研究所宋春嘯和Benjamin Schuster-Boeckler開發的一種新的DNA甲基化測序方法:TET輔助吡啶硼烷測序(TET-assisted pyridine borane sequencing,TAPS)。

      此方法同樣也是兩步轉化:

      第一步使用TET酶將5mC和5hmC轉化為5caC;

      第二步利用宋春嘯教授實驗室開發的一種新化學反應,將5caC轉化為胸腺嘧啶。

      TAPS這種方法與傳統BS處理以及EM-seq的數據不同的是,它是將5mC和5hmC轉化成胸腺嘧啶,不影響未修飾的胞嘧啶,可以保留更多的樣本原始信息和文庫多樣性。


      總結
      整體來看,BS處理樣本的方式由于長期的積累,有大量的數據,是公認的DNA甲基化檢測DNA處理的金標準。

      酶處理的方法相對比較新,但是從數據上看,對DNA的破壞性更小、建庫效率更高、數據下機的覆蓋度等性能都更加優秀。

      從元碼基因產出的使用酶轉化方案的標品數據來看,比對率和覆蓋度等性能都更加優異。


      參考文獻(向下滑動查看更多)

      [1].Frommer M, Mcdonald LE, Millar DS, Collist CM, Wattt F, Griggt GW, et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5- methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89:1827–31.

      [2].Grunau C, Clark SJ, Rosenthal A. Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters. Nucleic Acids Res. 2001;29:E65.

      [3].Warnecke PM, Stirzaker C, Song J, Grunau C, Melki JR, Clark SJ. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods. 2002;27:101–7.

      [4].Raizis AM, Schmitt F, Jost JP. A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Anal Biochem. 1995;226(1):161–6.

      [5].Holmes EE, Jung M, Meller S, Leisse A, Sailer V, Zech J, et al. Performance evaluation of kits for bisulfite-conversion of DNA from tissues, cell lines, FFPE tissues, aspirates, lavages, effusions, plasma, serum, and urine. PLoS One. 2014;9:1–15.

      [6.]Shiraishi M, Hayatsu H. High-speed conversion of cytosine to uracil in bisulfite genomic sequencing analysis of DNA methylation. DNA Res. 2004;11:409–15.

      [7].Tanaka K, Okamoto A. Degradation of DNA by bisulfite treatment. Bioorg Med Chem Lett. 2007;17:1912–5.

      [8].Olova N , Krueger F , Andrews S , et al. Comparison of whole-genome bisulfite sequencing library preparation strategies identifies sources of biases affecting DNA methylation data[J]. Genome Biology, 2018, 19(1):33.


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